Part. I 合成微生物的短小精練之道 Synthetic microbe has fewest genes, but many mysteries

小傢伙473個基因中有三分之一功能不明

作者 Robert F. Service

論及基因體大小,一種罕見的日本花種,Paris japonica (俗名:衣笠草 aka 日本重樓),是目前的重量級冠軍,它挾帶著比人類多50倍的DNA量。而在這場較量的彼端,加州的培養皿中出了一名新的輕量級紀錄保持人。本周的《科學》雜誌中,一群由基因體定序先驅,克雷格-凡特(Craig Venter)所領頭的研究者們,表示他們加工出了擁有最小基因體---與最少基因---的菌種,甚於任何生物體,並且只有衣笠草基因體的1/282,000倍大。被稱為小合3.0 (Syn 3.0) 的新生命,擁有一組被削頭去尾到只能進行生存與繁殖的基因體,僅僅包含了473個基因。讓哈佛大學的合成生物學家(synthetic biologist),喬治-教奇(George Church)不禁讚嘆,「這可是好個壯舉。」

這個小生命的線狀基因結構使得演化學家和生技學家們通通嗨起來了,因為它能讓他們利用這個原型,漸漸加入新的基因以測試自己的實驗結果。「如果想創造基因體健全配置的活細胞,這是非常重要的一個里程碑。」劍橋麻省理工學院的合成生物學家,克里斯-伏鄂(Chris Voigt)如是說。但伏鄂與其他同事語帶保留,因為小合3.0的149對基因---幾乎占了它整個基因體的三分之一---仍然功能不明。學者們的首要任務就是偵查這些基因所扮演的角色,他們所帶有的新信,或許能使我們洞見生命最基礎的生理奧秘。

小合3.0,顧名思義,它並不是第一個凡特所創造的合成生命,凡特帶領了整個 J. 克雷格-凡特研究機構(JCVI),同時也是生技公司:合成基因體(Synthetic Genomics)的創辦者。兩個組織都坐落於加州的聖地牙哥。在2010年,凡特的團隊報告他們已經合成了Mycoplasma mycoides (俗名:絲狀黴漿菌)的完整染色體---它有著相對較小的基因體---並且將這個染色體轉植進入M. capricolum (俗名:魔羯黴漿菌)的獨立個體中,後者已經被萃取移除了DNA。在一陣灰頭土臉的失敗後,他們讓合成微生物成功運作起來,並且自行合成了屬於絲狀黴漿菌,而非摩羯黴漿菌的蛋白質。(參見《科學》雜誌,2010年5月21日,第958頁) 然而,研究者們讓他們的第一項合成實驗品,小合1.0的遺傳物質,保留得和親代一模一樣,惟加入了一點浮水印DNA。

在近期的任務中,凡特與他的計劃領頭羊,JCVI的克萊德-胡契森(Clyde Hutchison),發願要創造生命所需的一份最小基因組,並且就從剝除小合1.0的非必需基因做起。他們起初分成兩組,任務都一樣:利用所有已知的基因體知識,設計出一個理論上存在的最小細菌染色體。兩者的提議接著都是進行基因體合成,並且將之轉植進入魔羯黴漿菌,瞧瞧是否能夠產生出堪用的有機物質。

「意外的是我們失敗了,」凡特說,「我得說我非常驚訝。」兩者的染色體都沒能創造出活的微生物。凡特認為,很明顯的,「我們目前的生物知識,還不足以讓我們悠哉悠哉就打造出活的生命體。」

凡特與他的同事們倒是利用試煉和失誤得到了較佳的成果。他們將小合1.0的基因體和上頭的901個基因捌分成八個區段。在每個區段的頭尾,他們添上了特別的DNA標籤,讓每個片段能夠輕易地重組。這讓他們能把不同區段視為獨立的模型來操作,輪流移除其中任一段,刪除DNA殘塊,接著重組整個基因體,放回魔羯菌的母體中,看看能不能創造出活細胞。如果某個被更動的基因體失敗了,他們就知道自己切除的是需要被保留的基因。研究者們也利用插入稱為轉座子(transposon)的外源遺傳物質,以此干擾不同基因的方式,評鑑了微生物體內眾多基因的重要性。

這使得他們得以系統性地刪減掉沒有必要功能,或是功能有重複的基因片段。最後,凡特聲稱他的團隊在動工創造小合3.0前,建立、設計、並測試了「上百種」的結構,所依靠的基因體大約僅有小合1.0的一半。(小合2.0是這個過程的轉運階段成品,是第一個基因體比M. genitalium:泄殖道黴漿菌還小的微生物;後者是自然生物體中擁有最少基因的物種,僅有525對基因。)

一旦刪減完成,研究者們就會重新排序剩餘的基因,並且標齊那些能夠在常態下運作的片段。這個整理基因體的手法,跟下令電腦壓縮並重整檔案,以便省下硬碟空間是差不多的概念。伏鄂說,這應該會讓未來使用小合3.0做實驗的合成生物學家們,做起事來快活一點兒。

新生命的基因體總共帶有531,000份鹼基對,其實不比泄殖道黴漿菌的600,000少了多少。但泄殖道黴漿菌的生長速度非常緩慢,要花上數週才能使自己的菌落倍增。相比之下,小合3.0只需要3小時就能進行倍增,暗示了它的基因體從環肥變成燕瘦之後,反而增加了它的繁衍性。凡特說,「我們不敢說這就是真正的最小基因體,」然而,就目前看來,小合3.0在世界基因體的輕量級盃裡面,還能穩坐寶座好段日子。

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同場加映:合成生物學(維基百科)、黴漿菌(也是維基)

 

(更)

Part II. 最小細菌基因體的設計與合成 Design and synthesis of a minimal bacterial genome

作者:Clyde A. Hutchison III,*† Ray-Yuan Chuang,† Vladimir N. Noskov, Nacyra Assad-Garcia, Thomas J. Deerinck, Mark H. Ellisman, John Gill, Krishna Kannan, Bogumil J. Karas, Li Ma, James F. Pelletier, Zhi-Qing Qi, R. Alexander Richter, Elizabeth A. Strychalski, Lijie Sun, Yo Suzuki, Billyana Tsvetanova, Kim S. Wise, Hamilton O. Smith, John I. Glass, Chuck Merryman, Daniel G. Gibson, J. Craig Venter*

引介:

1984年,能夠自我繁衍的最簡單細胞,黴漿菌,被認為是理解生命基本原則的典範。在1995年,我們報告了第一個完整的細胞基因體定序(Haemophilus influenzae,俗名流感嗜血桿菌,1815個基因,以及泄殖道黴漿菌,525個基因。) 這些序列的相互比較展現出了一個濃縮的核心序列,包含了250個必需性基因,比任一個基因體都小。1999年,我們研發出了一種通用性的轉座子誘變法(transposon mutagenesis),並經由實驗呈現了,即便擁有自然界中能自主複製的最小基因體,泄殖道黴漿菌的許多基因也對於生長毫無助益。這暗示了製造出一個比任何自然界生物都還簡單的最小細胞是有可能的。如今,完整的基因體已經能用化學合成的多核苷酸(oligonucletide)鏈建立而成,並且在植入相容性高的細胞環境後甦生。我們應用了這項全基因體設計與合成的技術,著手處理細胞基因體最小化的問題。

原理:

自從首次基因體定序開始,利用基因比對的方法,在菌種模型上檢驗非必需基因和決定核心基因功能的工程已經數見不鮮。通常,超過一個以上的基因產物能執行特定的必需性功能。在這樣的情況下,沒有一個基因是絕對必須的,也並不一定會被保留下來。因此,我們很難光憑這些手法就確認一組基因是否能組成一個可運作的基因體。我們想要做的,是經由實驗上的設計和建構,決定出一個最小的細胞基因體,並且檢驗它的可行性。我們的目標即是創造出一個極簡細胞,能夠檢驗每個基因所帶有的分子和生物功能。

成果: 

全基因體設計與合成的目的,是想讓絲狀黴漿菌JCVI-syn1.0的1079仟鹼基對(kilobase pair, kbp)合成基因體達到最小化。原初的設計奠基於所有已知的分子生物學知識,以及有限的轉座子誘變資料,最後卻無法製造出可行的細胞。改良後的轉座子誘變法,則找出了一組對於強力生長非常重要的準必需性(quasi-essential)基因,同時解釋了我們原初設計的失誤為何。在三次的設計、合成與檢驗,並加入了準必需基因之後,才讓JCVI-syn3.0得以問世(531kbp,帶有473個基因)。它的基因體比自然界中任何能自主複製的細胞都來得小。JCVI-syn3.0的增殖時間約莫為180分鐘,能產生出型態近似於JCVI-syn1.0的菌落,並且在顯微視野下呈現出多態性(polymorphic)。

結論: 

最小細胞的概念乍看之下簡單,卻在進一步的觀察下變得複雜許多。除了必需性和非必需性的基因之外,還有許多準必需性基因存在,它們在細胞運作的可行性上並未扮演關鍵性的角色,卻是細胞強力生長時不可或缺的一份子。因此,在基因體最小化的過程中,基因體的尺寸和生長速率之間有了些取捨。JCVI-syn3.0是趨近最小細胞基因體的典範,在最小基因體尺寸和可行的生長速率間達到了平衡。它擁有絕大部分能夠合成與製造大型分子的基因。然而,出乎意料地,它也包含了149個生物功能不明的基因,暗示著仍有一些生命需要而尚不為人知的功能存在。JCVI-syn3.0無疑是個調查核心功能與探索全基因體設計的廣用型平台。

Syn3.0.jpg

JCVI-syn3.0的四個設計-建構-測試循環

(A)基因體設計的循環,在酵母菌中用各種手法進行合成與複製,並且利用基因體轉殖測試可行度。在每次循環之後,受測基因的必需性會用轉座子誘導法進行再評估。

(B)JCVI-syn1.0(外側藍環)和JCVI-syn3.0(內側紅帶)的比較,展現了八個片段的分割。外環的紅色尺條指出了JCVI-syn3.0保留下來的區塊。

(C)JCVI-syn3.0的群落,展現出這個球型結構的尺寸多樣性。(比例條為200奈米)

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